制备纳米乳化紫杉醇使用MPEG - PLGA的嵌段共聚物
摘要：
在这项工作中，我们制备紫杉醇纳米乳剂使用的是自微乳化给药系统（ smedds ） ，以增加紫杉醇的疗效。作为紫杉醇载体，我们选择MPEG - PLGA的嵌段共聚物。紫杉醇和MPEG - PLGA的嵌段共聚物均匀分散在如四甘醇， cremophor ELP及labrasol的溶剂中。在动态光散射下，紫杉醇纳米乳剂液滴的大小一般在200-400nm之间。自微乳化系统为制备纳米乳剂开辟了新的空间。紫杉醇纳米乳剂的稳定性主要取决于MPEG - PLGA的嵌段共聚物的HLB值为准。最后，我们证实在这方面的研究可以应用到制备纳米紫杉醇乳剂中。
关键词：纳米乳液 紫杉醇 MPEG - PLGA的嵌段共聚物 纳米大小
1 导言 紫杉醇对各种肿瘤，如乳癌，卵巢癌，肺癌，宫颈癌，和急性白血病的发展[ 1-3 ]等在临床试验中表现出显著的抑制作用。紫杉醇是一种疏水性药物，在水中的溶解度低。因此，实际应用是有限的，由于他们在水中的低溶解度降低了治疗指数[ 4,5 ]。目前只有以酒精和cremophor ELP为溶剂的该类剂型的紫杉醇可以应用于临床治疗中。 最近，一直侧重于发展各种紫杉醇给药系统，如脂质体、乳液、胶束、微球、聚合物纳米粒子[ 9-11] 。其中，乳液可以为提供良好的生物相容性，可溶解水溶性较差的药物或高浓度的亲脂性药物。诸多乳化方法中，自微乳化药物传递系统（ smedds ）是创造良好治疗效果[ 12,13 ] 的较好方法。Smedds系统是油、表面活性剂以及一种或多种助表面活性剂，在搅拌下形成的油水混合物。利用生物降解聚合物是制备纳米或微乳液是的一种方法。可生物降解聚合物作为给药载体具有很大的潜力。在诸多的可生物降解药物载体中，聚（ D，L -乳酸-合作-乙交酯）（ PLGA）是其中最有吸引力的可生物降解的聚合物，因为他们的水解后 可以从组织或细胞[ 14 ]中被吸收或者被排出而不产生毒性 。聚（乙二醇）（聚乙二醇）已经被美国食品药品管理局认可并且广泛的应用于生物医学研究和应用。此外，聚乙二醇部分是亲水性的一部分，能够改变具有疏水性和可生物降解的PLGA部分的理化性能。最近，我们研究甲氧聚（乙烯乙二醇） （MPEG ） - PLGA的嵌段共聚物作为药物载体[ 15 ] 。MPEG - PLGA的嵌段共聚物的亲水亲油平衡值是药物控制释放及保持药物内在性能的关键[ 16-19 ] 。因此，我们假设的MPEG-PLGA的嵌段共聚物可以做为紫杉醇的载体。本研究的主要目的是制备紫杉醇自微乳化给药系统，由四甘醇、 cremophor ELP、labrasol和MPEG-PLGA的嵌段共聚物组成。
2 实验2.1 材料：MPEG（2000g/ mol ）、L -丙交酯的结晶、乙酸乙酯、紫杉醇（ genexol ® ）三阳genex有限公司（韩国汉城）、caprylocaproyl macrogol - 8甘油酯（ labrasol ® ） 盖提佛斯（韦斯特伍德，新泽西州） 、cremophor ELP巴斯夫公司（德国）。 tetraglycolwas西格玛化工有限公司（圣路易斯，MO，美国）。
2.2 测量： 对MPEG-PLGA的嵌段共聚物的分子量和分子量分布进行测量是使用futecs-3000GPC系统（ shodex里- 71探测器），氯仿为淋洗液，流速为0.8ml/min。动态光散射测量使用埃尔斯- 8000（日本大冢制药株式会社电子， 日本）。核磁共振光谱测定使用布鲁克300和500MHz。
2.3 合成MPEG -PLGA
所有玻璃器材均用氮气流进行真空干燥。聚合过程所需MPEG - PLGA的与PLGA的分子量（3500g/ mol的）如下：MPEG（2000g/ mol）（ 1.5g， 0.75 mol）和甲苯（ 100ml）。 对MPEG进行共沸蒸馏以除去水。甲苯也会随后蒸发掉。取LA（ 2.1g，14.5 mol ）和GA（ 0.5g，4.5 mol）在室温条件及氮气流下加入到MPEG溶液中， 其次是增加0.9毫升的0.1M溶液，130℃混合搅拌24小时。反应混合物注入混合物正己烷和乙醚沉淀聚合物混合物中，脱离上清液。获得溶解在二氯甲烷中的聚合物，然后过滤。将聚合物溶液通过旋转蒸发仪收集并且真空干燥，得到无色聚合物晶体。嵌段共聚物PLGA部分分子重量的确定是比较核磁共振光谱终端甲氧质子信号的强度MPEG（ δ = 3.38 ppm和亚甲基质子信号的PLGA δ = 1.61和5.20 ppm的强度）。
2.4 使用MPEG -PLGA制备纳米乳液 使用MPEG - PLGA的嵌段共聚物、紫杉醇、表面活性剂和助表面活性剂可以制备一系列的自微乳化给药系统。简单来说，MPEG -PLGA 与紫杉醇被四甘醇溶解分装在玻璃小瓶中。再将表面活性剂和助表面活性剂经准确的称量加入。然后再经慢速混合搅拌和旋涡搅拌，直到紫杉醇已完全溶解。混合存放在室温下直到使用。
2.5 纳米乳液颗粒大小分析 取50 µl 的自微乳化给药系统加水至50ml于一个容量瓶中，轻轻混合，反复反转该瓶。液滴的大小在室温下测量。测量3次纳米乳液样品，然后取平均值做为乳液颗粒的大小。
2.6 电子显微镜（ AFM ） 将一滴自微乳化给药系统溶液地在硅晶片上用甲醇清洗后迅速被放置在液态氮中，冷冻干燥2天，再进行原子显微镜测量。
2.7 紫杉醇纳米乳剂的稳定性
将紫杉醇纳米乳剂置于在5ml小瓶，在100 rpm和37 ℃下离心7天。在设定的时间，液滴大小由测量3次纳米乳液样品后计算平均值得到。
3 结果与讨论：3.1 制备MPEG - PLGA的嵌段共聚物
合成MPEG - PLGA嵌段共聚物作为药物载体，LA和GA的聚合反应由乙醇起始开始聚合知道形成辛酸盐。MPEG - PLGA的核磁共振可以分别展示PLGA以及那些MPEG的特征峰。该聚合反应可以通过控制MPEG和PLGA的比例制备出不同的MPEG-PCL嵌段共聚物，从而控制了嵌段共聚物的亲水亲油平衡值（ HLB值）[ 20 ] 。
3.2 使用MPEG-PLGA制备紫杉醇纳米乳液
作为疏水部分的PLGA的分子量在控制紫杉醇作乳化过程发挥了重要作用。因此，PLGA部分的分子量在MPEG - PLGA的嵌段共聚物的使用在自微乳化给药系统中可以改变处方的构成。制备紫杉醇纳米乳剂成分主要有紫杉醇，油，表面活性剂和MPEG-PLGA的嵌段共聚物。
紫杉醇和MPEG -PLGA的嵌段共聚物溶解在混合了四甘醇、cremophorELP和Labrasol 构成的增溶系统中。制得的自微乳化给药系统颜色及透明度显示在下图。一号A 紫杉醇纳米乳液呈半透明状态。随着PLGA部分分子量越来越大自微乳化系统的颜色也逐渐加深。 所有处方中液滴的大小均在200-300nm之间。所有配方中液滴粒径分布均比较狭窄。利用不同的PLGA制得的紫杉醇纳米乳液液滴大小没有太大的差异。纳米乳液的形态由原子显微镜AFM观察得到。纳米乳液中球形液滴表面光滑，原子显微镜下液滴大小均一并且没有聚集和粘附现象。
3.3 紫杉醇纳米乳剂的稳定性 紫杉醇纳米乳剂在储存时的稳定性在维持紫杉醇治疗浓度及药效方面也很重要。因此，我们研究了不同分子量的PLGA制备的紫杉醇纳米乳剂在37 ℃7天内的贮藏稳定性。体系的颜色随放置时间和PLGA分子量的增加而变深。通过DLS的测量，F1处方紫杉醇纳米乳剂液滴大小随实验时间增加有微小减少，而F2和F3配方随着实验时间增加液滴大小也有所增大。特别是F2处方（ PLGA3500g/ mol）和F3（ PLGA9500g/ mol ）处方液滴大小由200 nm增加到1000～2000nm
此外，7天后紫杉醇纳米乳剂沉淀量的差异也与之前的实验相差的顺序相同。这表明，纳米乳液的稳定性强烈依赖于MPEG - PLGA的嵌段共聚物的HLB值。
4 结论: 我们成功的制备具有相同MPEG部分不同PLGA部分的具有不同HLB值得MPEG-PLGA嵌段共聚物。成功地利用紫杉醇、油、表面活性剂和MPEG-PLGA嵌段共聚物制备了紫杉醇自微乳化给药系统。自微乳化系统的研究使制备微乳的技术向前迈进一大步。 共聚物HLB值的下降使紫杉醇的储藏稳定性增强。这些结果证明了该配方的研究结果可用于紫杉醇临床试验。所以，研究紫杉醇自微乳化系统中紫杉醇在体内的释放是接下来我们要研究的工作。