模拟微重力效应对大鼠成骨细胞Fzd9表达的影响

模拟微重力效应对大鼠成骨细胞Fzd9表达的影响

摘    要

长时间的太空飞行由于人体处于微重力环境，会导致宇航员出现严重的骨丢失现象，成骨细胞骨形成作用的减少是骨丢失的一个重要原因。成骨细胞中Wnt信号通路是调控骨形成的一个非常重要的信号通路，而Fzd9是存在于细胞膜上的Wnt蛋白的重要受体蛋白。在成骨诱导分化早期，所有Fzd成员中仅有Fzd9表达上升。敲除Fzd9基因的小鼠会表现出明显的低骨量，显示出Fzd9在成骨骨形成方面的重要调控作用，但在微重力导致的骨丢失中Fzd9起到什么作用还是未知的。本项目利用原代培养的大鼠成骨细胞，以单轴回转器对细胞加载模拟微重力效应，利用RT-PCR、Real Time-PCR和Western blotting等方法，研究了成骨细胞中Fzd9基因水平和蛋白水平的表达变化情况，发现随着加载模拟微重力效应的时间增加，Fzd9的相对表达量在基因水平和蛋白水平均有显著性的降低。我们还发现成骨细胞ALP的活力随着加载时间的延长而降低，表明其成骨能力也降低了，与Fzd9的表达量降低相一致，由此我们的实验结果证实了Fzd9在微重力引起的骨丢失中可能存在着重要调控作用，为探索微重力环境骨丢失机制打下基础。

关键词：模拟微重力效应，成骨细胞，骨丢失，Fzd9

Abstract

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目     录

1 绪论 1

1.1 课题背景 1

1.2 国内外研究现状 2

2 实验方案设计 8

2.1 实验目的 8

2.2 实验方案设计及论证 8

3 实验材料 13

3.1 动物材料 13

3.2 主要试剂 13

3.3 主要设备 14

3.4 主要试剂配制 15

3.5 引物 16

4 实验方法 17

4.1 细胞培养 17

4.2 成骨细胞的鉴定 18

4.3 加载模拟微重力效应 19

4.4 成骨能力的检测 19

4.5 基因水平的检测 20

4.6 蛋白水平的检测 23

5 数据处理 27

5.1 RT-PCR图片处理 27

5.2 Real Time-PCR图片处理 29

5.3 BCA法中蛋白浓度的计算 30

5.4 ALP活力的计算 30

5.5 Western blotting图片处理 31

6 结果及分析 32

6.1 成骨细胞形态的变化 32

6.2 成骨细胞的鉴定 33

6.3 加载模拟微重力后细胞成骨能力的变化 33

6.4 RT-PCR结果 34

6.5 Real Time-PCR结果 35

6.6 Western blotting结果 36

7 讨论 37

结论 39

致谢 40

参考文献 41