杭白菊中多菌灵残留的免疫快速检测方法构建开题报告

^范文题目：杭白菊中多菌灵残留的免疫快速检测方法构建

A. 文献综述

一． 课题意义、背景

杭白菊（Chrysanthemum morifolium）为菊科植物菊的干燥头状花序，主要产自浙江嘉兴桐乡一带。杭白菊富含挥发油、总黄酮、木犀草素及其苷和多种微量元素。其味辛，甘，苦，性微寒，具有降压降脂，健脾通气，清肝明目，消炎解毒等功效。作为“浙八味”之一的杭白菊即可用于中药调理，也可用于保健饮品，是卫生部首批的药食同源道地药材[1]。同时随着中国经济的发展，与各国交流的增强。越来越多的西方国家逐渐接受了以自然疗法为核心的中医，不仅在医院中提供中医疗法，还得到了国外一些科学研究的认可。并且西方人也会选择一些药食同源的中药材作为自然食物和治疗药材。杭白菊便是其中之一，其出口已占据同类出口总额的60%以上[2]。

近年来，随着国内外需求的增长，我国杭白菊的种植面积及总产量也在逐渐增长。但在追求杭白菊种植面积和总产量增长的同时，对杭白菊的质量安全也得到了重视。从相关标准及规定中总结出，目前杭白菊中主要有氧乐果、乐果、敌敌畏、六六六、滴滴涕、氯氰菊酯、多菌灵、毒死蜱、氯戊菊酯、三唑磷、克百威、啶虫脒、三氯杀螨醇，乙酰甲胺磷，杀螟硫磷，涕灭威，甲基对硫磷，五氯硝基苯和艾氏剂等19个农药残留指标[2]。其中，农药多菌灵是杭白菊常用农药之一，该农药的欧盟MRL值为0.1（mg/kg），被欧盟分类为可能危害胎儿，可能损害（男性）生殖能力，并可能造成遗传基因损害。

杭白菊在栽培过程中白绢病已成为主要病害威胁，8月上旬至9月上旬的压条摘心期间是白绢病发病高峰期。因此在杭白菊生长后期会使用多菌灵等农药进行防治，效果明显且经济合理[3]。然而目前杭白菊多由散户种植，后由工厂收购，农民在种植过程中为提高产量，在防治病虫害时，农药用量往往会偏高，且参差不齐，使杭白菊被农药污染，存在多种农药残留。而杭白菊有关农药残留现状的公布数据较少，使杭白菊质量存在安全隐患。

    现今常用的多菌灵检测方法多集中于仪器方法，例如高效液相色谱（High Performance Liguid Chromatography，HPLC）[4, 5]。HPLC具有高精密度及灵敏度等优点，但由于在检测过程中前处理操作步骤多，试剂耗费量大；仪器检测时，使用仪器体积大，不易移动；整体耗费时间长，检测费用高等，已无法满足目前农药样品大批量、多批次的高通量检测和快速筛选。作为已得到广泛研究和应用的基础免疫分析法酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[6]，其可同时检测多个样品，具有高通量等优点，可应用在大量农业样品的检测中，弥补了仪器方法的不足。近年来，除广泛应用的ELISA外，国际上还开发了新型的药品残留检测技术，例如胶体金免疫层析法[7]。与传统ELISA相比，胶体金免疫层析法具有携带方便，结果肉眼可见，检测快速，操作简单和价格低廉等优点。

本课题旨在构建杭白菊中多菌灵农药残留的快速检测方法。在制备出多菌灵特异性识别的单克隆抗体的基础上，优化各项反应参数，建立酶联免疫吸附法（ELISA）及胶体金试纸法，对以桐乡为代表的杭白菊进行多菌灵农药残留的快速检测。

二．课题可行性

    单克隆抗体的制备是通过半抗原在小鼠体内引起免疫应答，使脾脏细胞产生特异性抗体。利用融合技术和筛选的手段得到具有强特异性的杂交瘤细胞，其产生的抗体便是单克隆抗体。

    酶联免疫吸附法（ELISA）是以抗原与抗体的特异结合、固相吸附反应为基础，把抗体作为生物化学检测器对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性或定量分析的一门技术。通过酶的催化作用，使底物显示，有利于增强和显现抗原-抗体间的相互作用。农药等小分子化合物的ELISA检测有直接竞争法和间接竞争法两种。其中，间接竞争法是将人工抗原固定在高吸附的酶标板上，使人工抗原和游离农药对抗体进行竞争结合反应。洗去未结合组分后，将于人工抗原结合的抗体进行酶标记二抗并通过底物显色来显现抗原-抗体间的相互作用。

    胶体金免疫层析技术是一种新型的膜层析检测技术。用胶体金标记抗体，将人工抗原固定在膜上，以待测样品为流动相，带动金标一抗上膜。在膜上待测样品与膜上的人工抗原对金标一抗形成竞争关系。最终以肉眼观察是否消线，来判断抗原-抗体间的相互作用。

本课题在原理上是完全可行的，且在国内外都有相关报道。但同时也存在技术难点。比如在制备抗体时，筛选获得高亲和力的农药抗体有一定难度。在酶联免疫吸附法（ELISA）方面，由于农药有结构相似的化合物，与抗体结合会有一定的交叉现象，使假阳性概率增加，导致检测结果准确率的降低。在胶体金免疫层析方面，部分测试样品中的基质会对测试结果有干扰。以上这些问题都需要通过摸索试验条件去克服。

三．研究方案

1.单抗免疫制备。选择多菌灵人工半抗原通过小鼠免疫及细胞融合，通过ELISA的筛选，最终获得对多菌灵结构特异性最高的单克隆抗体。

2.酶联免疫吸附法（ELISA）。使用制备出对多菌灵特异性识别的单克隆抗体，与包被在酶标板上的人工抗原，同时竞争半抗原多菌灵标样。通过优化，筛选出三者最优组合，做出标准曲线及计算出IC50。在此基础上，检测盲样杭白菊中多菌灵农药残留量是否超过欧盟MRL。

3.胶体金免疫检测。使用肉眼可见的胶体金标记制备出对多菌灵特异性识别的单克隆抗体，用空白样品为流动相，与膜上的人工抗原特异性结合，以肉眼可观察出线的深浅，来筛选出二者最适组合。以此组合，与含半抗原多菌灵标样的流动相，进行试验。测试出测试线消线的最低测试量。在此基础上，检测盲样杭白菊中多菌灵农药残留量是否超过欧盟MRL。

B. ^范文提纲格式

摘要

引言

1.1背景介绍

1.2 单抗的制备

1.3农药残留免疫分析方法

1.3.1酶联免疫吸附分析（ELISA）

1.3.2胶体金免疫分析

2. 多菌灵抗体的制备

2.1人工抗原制备

2.2 动物免疫

2.3 细胞融合及优化

2.4 腹水制备及纯化

2.5结果与分析

3.杭白菊中多菌灵的酶联免疫吸附检测

3.1材料

3.2仪器设备

3.3ELISA方法建立与优化

3.4杭白菊中多菌灵农药残留测定

3.5结果与分析

4.杭白菊中多菌灵的胶体金免疫层析检测

4.1材料

4.2仪器设备

4.3试纸条方法建立与优化

4.4杭白菊中多菌灵农药残留测定

4.5结果与分析

5. 总结与展望

C. 参考文献

References:

[1].沈瑶, 戴德江与沈颖, 浙江省杭白菊农药使用情况调查及对策建议. 浙江农业科学, 2017. 58(3): 第438-441,443页.

[2].刘岩等, 杭白菊质量安全现状及发展对策研究. 农产品质量与安全, 2019(06): 第68-72页.

[3].王建伟等, 杭白菊白绢病的研究. 浙江林学院学报, 1989(03): 第81-87页.

[4].赵静, 毒死蜱、多菌灵在杭白菊及其土壤中的残留动态研究, 2013, .

[5].吴加伦等, 高效液相色谱法测定元参、黄芩和杭白菊中的多菌灵残留. 农药学学报, 2010. 12(04): 第489-493页.

[6].桂文君, 农药残留ELISA速测试剂盒产业化技术研究, 2007, . 第 198页.

[7].Guo, L., et al., Gold Nanoparticle-Based Paper Sensor for Simultaneous Detection of 11 Benzimidazoles by One Monoclonal Antibody. Small, 2018. 14(6).