庆大霉素普鲁卡因维生素B12颗粒中庆大霉素含量测定方法的研究开题报告

（一）国内研究现状

硫酸庆大霉素是氨基糖苷类抗生素, 由多个组分组成, 其抗菌机理主要是阻碍细菌蛋白质的合成, 是目前使用较为广泛的抗生素。由于硫酸庆大霉素组分较多, 用化学检测方法还不能完全体现其抗菌能力, 所以效价测定在控制其质量方面尚不可替代。现在常用的效价测定方法还普遍是管碟法, 2005 年中国药典收载了比浊法测定抗生素效价 [ 1, 2] ,但在实际检验中应用尚少。 

庆大霉素普鲁卡因维生素B12颗粒是我国特有的庆大霉素复方制剂，是治疗慢性，浅表性胃炎的常用药，性价比高，疗效好，深受患者信赖。目前执行的是化学药品地方标准上升国家标准第六册及第十六册标准WS-10001-（HD-0547）-2002[3]，此中规定硫酸庆大霉素含量按照中国药典二部检测[1]。

近年来，采用管碟法测定其硫酸庆大霉素效价时, 发现供试品溶液的抑菌圈总会出现“双圈、虚圈”现象，难以进行测量, 从而难以准确测定其效价，即使调整试验条件消除了“双圈”，依然会存在结果超上限的问题。长期以来，给厂家和检验机构带来很大困扰，增加了许多工作量，却依然无法得到较好的解决。

从理论上来说，抗生素效价测定方法依据的是量反应平行线原理，即标准品与供试品剂量的反应直线是相互平行的，若不平行，则斜率不等，计算所得结果将产生较大的误差。影响因素主要是标准品与供试品的同质性，一是因为多组分抗生素标准品所含的抗菌活性物质或影响抗菌活性（增强或拮抗）物质的量与供试品有所不同，可使量反应直线不平行；二是因为供试品中所含有的维生素、氨基酸、无机盐或其他生长物质标准品中没有，在营养条件差的培养基上即会产生影响；三是因为用于标准品、供试品溶液制备的缓冲溶液的pH 值、盐浓度不相同。

由此分析，我们初步估计管碟法测定庆大霉素普鲁卡因维生素B12颗粒效价的误差是辅料对结果产生的影响。含硫酸庆大霉素的颗粒剂多为儿童用药, 厂家需要添加大量糖、矫味剂等辅料[4]。该颗粒剂主药与辅料的比例为10mg/2g（即0.5% ），辅料的比例过大且其中大部分为黏度较高的糖分，在营养条件差的培养基上可能会影响抑菌圈的大小，从而使测定结果产生偏离。这种特殊情况使我们考虑改用比浊法来对其进行测定。采用比浊法测定时, 由于测定浓度很低, 样品溶液中辅料的浓度相应显著减少, 从而可减小对测定的干扰[5]。

另一方面，采用管碟法测定庆大霉素普鲁卡因维生素B12颗粒的效价时，会受扩散系数、培养基黏稠度、抑菌圈大小等诸多因素影响，而且样品中组分配比不完全相同，故测定结果误差较大。同时，管碟法检测时间过长, 参数不稳定, 受外界干扰较大。而比浊法测定是在液体培养基中进行，可避免上述因素的影响。其用固定波长测定菌液的吸光度，精密度优于管碟法对抑菌圈的测定，且培养时间短，因此测定更为快速、准确[6]。采用比浊法来对庆大霉素普鲁卡因维生素B12颗粒进行效价测定及进一步的方法学研究可以摒除多数外在干扰因素，直观、快捷地反映药品本身存在的问题。

目前，庆大霉素普鲁卡因维生素B12颗粒管碟法测定效价结果偏高的原因犹未可知，作为复方制剂，其各成分之间以及辅料的干扰不可忽略，庆大霉素自身各组分的比例是否合适也对敏感菌的生长产生极大的影响，以上因素均有待试验进行进一步验证。采用比浊法能够准确、快速地对上述各因素进行考察和分析，找到主要干扰因素。经过进一步的调整试验条件，有望建立一个比浊法测定庆大霉素普鲁卡因维生素B12颗粒中硫酸庆大霉素效价的合适方法，能准确反映复方庆大霉素颗粒剂中硫酸庆大霉素的真实效价，解决这一困扰大家多时的难题[7,8]。

霍启录等人利用分光光度计测定浊度，做了硫酸庆大霉素的浊度法和管碟法的评价，取得了较好的效果[9]。高燕霞等人利用第一代比浊仪测定硫酸庆大霉素的效价，通过数据更加印证了浊度法对于效价测定的优势[10]。罗晓茹等人利用新一代比浊仪考察了多种硫酸庆大霉素制剂，对比浊法的影响因素做了归纳，并提出控制措施，大大提高实验成功几率，确保了结果的可靠性[11,12]。

刘英等人研究发现[13]：不同品牌培养基对管碟法测定结果影响较大，即使是同一品牌的培养基由于不同批次之间的质量差异对管碟法测定影响也很大，同时比浊法测定结果不受培养基的影响。分析其原因在于管碟法中庆大霉素各组分和有关物质在不同质量的固体培养基中扩散的差异导致其含量的差异，充分说明了效价测定的前提是标准品和供试品的同质性，这不仅包括主要活性组分的同质，也包括杂质的同质性。比浊法测定结果不受不同品牌培养基影响的原因在于庆大霉素各组分和有关物质在液体培养基中无扩散的影响，因而结果相差不大。

（二）国外研究现状

对于硫酸庆大霉素的效价测定方法，欧洲药典8.0中[14]收载了管碟法和比浊法2种方法。美国药典36版[15]和日本药典第16版[16]只收载了硫酸庆大霉素的管碟法。

综上所述：国际上针对硫酸庆大霉素的含量测定普遍采用管碟法。但在庆大霉素普鲁卡因维生素B12颗粒剂的庆大霉素含量测定实际操作中会存在很多问题，如出现双圈，结果偏高，偏离平行不合格，可信限偏高等问题，国内已经有很多关于浊度法的研究和讨论，完全可以开创更新，用浊度法来替代管碟法。完全可以引导企业在有条件的情况下，在注册申报、日常检验中采用浊度法来测定庆大霉素普鲁卡因维生素B12颗粒剂中的庆大霉素的含量。

二、^范文提纲

1 仪器与实验材料

1.1 仪器

   WBS-100微生物比浊法测定仪 、抑菌圈测量仪，由北京先驱威锋技术开发公司提供；万分之一或十万分之一电子天平；高压灭菌锅、恒温干燥箱；容量瓶、移液管、刻度吸管

1.2  实验材料

金黄色葡萄球菌、庆大霉素标准品、庆大霉素原料药、普鲁卡因原料药、维生素B12原料药、蔗糖、庆大霉素普鲁卡因维生素B12颗粒及其辅料，抗生素检定培养基Ⅲ号等

2  实验方法

2.1 金黄色葡萄球菌悬液的制备

2.2  III号培养基的制备

2.3  pH7.0磷酸盐缓冲液的制备

2.4  抗生素溶液的配制

2.5 抗生素溶液的分装

2.6培养基的接种

2.7 培养基的分装

2.8 培养

2.9 测量与计算

3   实验结果

3.1 线性实验

3.2 准确度实验

3.3重复性实验

3.4 样品测定

4  讨论

三、参考文献

[1] 国家药典委员会. 中国药典(二部)[ M ]. 北京: 化学工业出版社, 20010: 附录93

[2] 杨亚莉,胡昌勤. 中国药典2005年版微生物检定法的增修订情况及要点[J] . 中国抗生素杂志, 2005,30( 12):7211

[3] 国家药品标准 化学药品地方标准上升国家标准 第六册 国家药典委员会编 2002年 6-149

[4] 高新贞,于风平. 对含糖庆大霉素颗粒剂效价测定培养基的改进[J]. 齐鲁药事, 2009,28(3):180-182

[5] 汪 洋,闵 盛. 微生物浊度法测定硫酸庆大霉素颗粒的效价[J]. 成都医学院学报，2009,4(3)：205-207

[6] 高燕霞，姜建国，李玉兰. 两种方法测定硫酸庆大霉素颗粒剂生物效价的比较[J]. 中国药业, 2007,16(7):10-11

[7] 余少婷, 梁碧心, 王莉蓓. 硫酸庆大霉素微生物检定法缓冲液的改进[J]. 广东药学院学报, 2004, 20( 5) : 499-500

[8]  张永泉, 杜战江, 刘云. 小儿硫酸庆大霉素颗粒含量测定方法研究[J].中国药事, 2000, 3: 177-178

[9] 霍启录，侯连兵，邵红霞.微生物比浊法与管碟法测定硫酸庆大霉素效价的评价[J].中国药房，2000 11(1)：37

[10] 高燕霞，姜建国，李玉兰.两种方法测定硫酸庆大霉素颗粒剂生物效价的比较[J].中国药业，2007 16(7)：10

[11] 罗晓茹，魏立平，王亚男.浊度法测定硫酸庆大霉素及其制剂效价的影响因素[J].解放军学报，2010 26(1)：73

[12] 李哲媛，康勇，范兵.微生物比浊法测定硫酸庆大霉素注射液的效价[J].中国药业，2005 14(3)：38

[13] 刘 英,王立萍. 庆大霉素组分和有关物质对效价的影响[J]. 中国抗生素杂志，2012，37（2）：127-131

[14] EP 8.0[M], Vol(Ⅰ), 202-207

[15] USP36 [M], 133-151

[16] JP16 [M], General Tests, 96-100