高温菜籽粕发酵产灵菌红素的工艺优化开题报告

图1 灵菌红素的分子结构

灵菌红素是一类天然红色素，具有绿色反光，熔点为151~152℃，几乎不溶于水，为脂溶性色素，在甲醇溶液中，酸性条件下535nm处特征吸收峰，碱性条件下466nm处有特征吸收峰，可利用此特征峰测定灵菌红素的含量。早期研究结果表明灵菌红素对细胞有较大的毒性，因而未进行研发。近年来研究发现，灵菌红素类化合物在一定剂量范围内表现良好的抗肿瘤及免疫抑制活性，且引起细胞凋亡的作用机制完全不同于当前的临床药物。

由于发现灵菌红素的抗肿瘤活性、免疫抑制活性，它的价值也随之提高，因此人们开始在灵菌红素发酵生产条件优化方面展开了探索，文献表明目前人工合成灵菌红素很困难，而且产量不高，最重要的是人工合成的不是天然的灵菌红素，所以人们更多的研究是转向其微生物发酵生产。有关实验证明，天然高产灵菌红素的发酵生产是通过对发酵粘质沙雷氏菌培养并进行培养基优化并大量获得灵菌红素的。

粘质沙雷氏菌是一种兼性厌氧型，可运动的革兰氏阴性棒状细菌，属于肠杆菌属分裂的沙雷氏菌属的一支，这种细菌病原体具有广泛的宿主范围，能够感染到人类。粘质沙雷氏菌在许多方面有自身的特点，它可以分泌细胞外几丁质酶、核酸酶、脂肪酶和几个蛋白酶以及产生润湿剂或表面活性剂，这有助于在表面的殖民化。它还可以生产DNA酶、明胶酶、过氧化氢酶、脂酶、赖氨酸脱羧酶、乙偶姻；然而，它是氧化酶阴性。灵菌红素是一种联三吡咯抗生素，经研究表明，是由粘质沙雷氏菌生物合成的一种次级代谢物。

粘质沙雷氏菌在28℃下培养产生红色色素，37℃下培养不产红色色素而恢复在28℃下培养又产生红色色素；它具有三吡咯环的基本结构，其中的一个吡咯环C2上带有一个甲基，C3上则有一个戊基。灵菌红素是一种红色物质，虽然其对于生产者的作用和意义还不是彻底明了，但它已被发现具有多种生物活性作用，能抗癌，抗微生物，抗疟疾，抗霉，免疫抑制的作用。其中抗癌方面，因为其具有癌组织的高针对性和对正常细胞则表现的低毒害作用，而成为一种非常有潜力的抗癌物质。

二、^范文提纲

1菜籽粕组分测定

1.1蛋白质量分数测定参照GB/T5009.5-2003

1.2粗脂肪含量测定参照GB/T 5009.6-2003

1.3水分含量的测定参照GB/T 5009.3-2003

1.4灰分含量的测定参照GB/T 5009.4-2003

2灵菌红素含量测定

2.1粘质沙雷氏菌生长曲线的绘制

采用比浊法测定菌体含量，取适量发酵液进行10稀释，以未接种的培养基做等量对照，在波长600nm处，测定细胞悬浮液的吸光度，在3个250mL的三角瓶中分别装50mL种子培养基，分别加入活化12h种子液1mL，30℃、200r/min培养24h，每隔1h测定骑在波长600nm下的吸光度，绘制粘质沙雷氏菌的生长曲线。

2.2灵菌红素标准曲线

配制不同质量浓度的灵菌红素酸性甲醇（pH 3）溶液，1、2、3、4、5、6g/100ml,在535nm处测吸光度。

3发酵条件优化

3.1碳源的确定

以不同碳源（淀粉、蔗糖、麦芽糖、甘油、小麦粉、玉米粉、红薯粉）取代基本发酵培养基中的葡萄糖进行发酵，200r/min、30℃培养30h后取样测定灵菌红素含量。

3.2单因素试验

以灵菌红素含量为指标，分别考察菜籽粕、碳源、摇床转速、接种量、初始pH值、发酵时间、发酵温度、无机盐添加量对灵菌红素产量的影响。

3.3 PB试验

在单因素实验基础上，选取菜籽粕添加量、碳源、摇床转速、接种量、初始pH值、无机盐添加量中上升区间的两个水平设计PB试验，通过对影响灵菌红素含量的因素影响大小进行排序，筛选出主要因素。

3.4响应面分析

以PB试验的实验结果分析为基础，筛选出三个影响灵菌红素产量的主要因素，研究主要因素的最佳水平以及主要因素之间是否存在交互性，通过灵菌红素的产量指标确定最佳的工艺条件。

4灵菌红素的检测方法

取20mL发酵液离心去除上清液，以甲醇作为浸提液溶解沉淀，细胞超声波辅助浸提（超声波超声时间10s、工作间隙3s、工作次数7次、工作最大功率200W），室温下浸提10min，收集融入色素的甲醇溶液，反复提取直到甲醇溶液不变色。将收集的甲醇溶液进一步离心，得上清液，调节pH至3，在紫外分光光度计下535nm处测定OD值，计算灵菌红素含量并绘图。

三、参考文献

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