枸杞中枸杞多糖的提取及分离纯化工艺的研究_开题报告

现代医学临床研究认为，枸杞的重要提取物之一就是枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides），枸杞的营养价值就在于其中含有多糖，枸杞子是茄科植物枸杞的果实是我国的一种传统中药 经研究表明枸杞多糖是枸杞子调节免疫延衰老的主要活性成份，可改善老年人易疲劳食欲不振和视力模糊等症状，并具有降血脂、抗脂肪肝、抗衰老等作用，而其药理作用与其生物活性成分枸杞多糖密切相关。将其作为功能因子来开发保健食品具有广阔的发展前景。

LBP是一种有效的免疫增强剂,在细胞免疫和体液免疫调节中具有重要作用,对肿瘤免疫监视系统的主要细胞免疫功能包括T、CTL、NK和Mφ等细胞均有明显作用，还能促进IL-2、IL-23、IL-6和TNF的产生，促进IL-2R的表达。LBP不仅能增强荷瘤小鼠的免疫功能,而且还能对抗化疗、放疗、免疫和造血抑制的 副反应。在抗肿瘤方面，LBP单用也有一定效果，如果与化疗或小剂量CP合用更能增强抗瘤效果。从学术上讲，两种免疫增强剂菌酶合用（如LBP与CP菌苗合用）具有协同作用；从应用上讲，两种免疫剂合用更能避免化疗和放疗的副作用，增强抗癌效果。LBP不仅是一种调节免疫反应的生物反应调节剂（BRM）， 而且还可能通过NIM网络发挥抗癌作用,值得重视和研究。NIM网络中各环节的各种分子的细节有待深入研究补充，NIM网络的构思是具有广范现实意义的，是符合生命科学的，也是与中医传统的整体思想体系不谋而合的，这对探讨艾滋病的治疗也具有较好的前景[24]。

1 枸杞多糖的组成和理化性质

1.1 枸杞多糖(LBP)的化学成分

枸杞多糖(LBP)是由阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖及半乳糖醛组成的酸性杂多糖的糖链与蛋白质的肽链以共价键的形式结合的含肽多糖，分子量在1×105μ[1]。

研究者已采用DEAE2纤维素、DEAE2葡聚糖凝胶和其他各种不同类型的凝胶柱层析法,从枸杞粗多糖中分级纯化出蛋白质多糖G、LBP26、LBPI、LBPII、LBPIV、LBGP、LBNP、LBPC2、LBPC410个不同分子量范围的均一级分的多糖[2- 12]。

1.2 枸杞多糖(LBP)的理化性质

冷冻干燥得到的枸杞多糖为白色略带棕色纤维状疏松固体，按LBP-Ⅰ、LBP-Ⅱ、LBP-Ⅲ、LBP-Ⅳ的顺序，其水溶性依次递减，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。硫酸-苯酚、硫酸-蒽酮、硫酸-咔唑反应、考马斯亮蓝染色反应呈阳性，斐林试验碘-碘化钾反应呈阴性[13]。

2 枸杞多糖的功能作用

传统的中医理论认为：其味甘，性平，具有补肝肾、益精血、明目之功能。枸杞中含有枸杞多糖、多种氨基酸、微量元素、维生素、牛磺酸、生物碱、挥发油等化学成分。现代科学研究证明：枸杞具有调节免疫功能、降血糖、降血脂、抗衰老、抗肿瘤等作用，而其药理作用与其生物活性成分枸杞多糖(LBP)密切相关。

2.1抗衰老作用

李响[14]等研究得到：枸杞多糖提高D- 半乳糖所致衰老模型小鼠皮肤中SOD活力作用较维生素E更为显著。SOD作为体内天然的抗氧化酶之一，有清除自由基的作用,其活力的提高有益于机体抗氧化能力[15-16]。枸杞多糖降低D- 半乳糖所致衰老模型小鼠皮肤中MDA含量作用也较维生素E显著，其机制可能为枸杞多糖通过提高细胞清除H2O2 和O2-能力，保护细胞免受自由基损伤，且可使成纤维细胞活性增强，胶原蛋白合成增加而延缓衰老进程。枸杞多糖可直接清除体内羟自由基，并能抑制自发或由羟自由基引发的脂质过氧化反应，从而减少羰基化合物的形成,通过降低蛋白质羰基化而发挥抗衰老作用[17]；也可以抑制黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转变，从而减少自由基产生；其还有很强的抗氧化作用，能保护细胞内抗氧化酶类活性，从而阻止多价不饱和脂肪酸的过氧化反应，抑制LPO生成，维持生物膜正常脂质结构和生理功能而发挥抗衰老作用。

2.2抗肿瘤作用

LBP能显著改善荷瘤小鼠的状况,使腹腔积液型荷瘤小鼠的生命延长41%-85%,并显著地抑制这两种实体瘤的生长,抑制率分别达到81%和72.9%。体外试验提示LBP能显著抑制人宫颈瘤Hela细胞和人胃腺癌MGC-803细胞的生长和繁殖，抑制癌细胞克隆的形成。

使用G57BL纯系小鼠及可移植性Lewis肺癌模型试验发现，LBP结合放疗显示出明显的放射增敏作用，剂量修饰因子平均为2.05；对急性乏氧性肿瘤细胞也有一定的放射增敏作用，且对机体无明显毒性作用。

LBP与卡氮芥合用对脑荷G4zn瘤小鼠进行治疗，发现两者合用不仅能延长受放射性元素头部照射小鼠的生存期，对改善小鼠的细胞免疫功能亦有明显的作用。LBP在体内、体外对LAK细胞均有抗肿瘤活性的调节作用。LBP注射老龄小鼠可显著促进脾细胞增殖，LAK活性可提高120%-200%， 体外白细胞介素-2（IL-2）用量可降低＞75%。LBP-X 对人白血病HL-60细胞生长亦有抑制作用，其抑制HL-60细胞增殖呈剂量依赖性关系，且可降低HL-60细胞的膜流动性。认为诱导HL-60细胞凋亡是LBP-X抗肿瘤的重要机制。

2.3 调节血脂和血糖

研究者应用枸杞和枸杞多糖及纯化组分(LBP、LBP- X) 对实验性高血脂兔的血脂进行了研究[18]，结果表明血脂下降平均值总胆固醇(TC) 为3139mmol/ L，血清甘油三脂(TG)为2177mmol/ L；4只灌胃LBP- X的高脂血症兔, 血脂下降平均值TC为4127mmol/L，TC为3150mmol/L，均达序贯试验降脂有效水平，假阳性率为5%， 降脂有效率均达100%。研究对正常小鼠的血糖和糖耐量的影响及对四氧嘧啶致高血糖小鼠的保护作用表明，对正常及糖尿病模型动物均有降血糖作用 能明显降低链佐星高血糖小鼠血糖并对链佐星引起的胰岛损伤具有保护作用。枸杞多糖可以成为极有前途的降糖保健品或口服降糖药物。

二．目前的研究现状

2 枸杞多糖的提取与精制

2.1 枸杞多糖的提取

枸杞多糖是一种易溶于热水或稀酸、稀碱溶液，能被乙醇、丙酮等有机溶剂析出的蛋白多糖，干燥后为白色纤维状疏松固体。实验室提取枸杞多糖的方法主要包括脱脂、水提、乙醇沉淀以及除杂等几个步骤。

传统的提取方法：枸杞子→烘干→氯仿-甲醇（2：1）脱脂→80%乙醇脱小分子糖→水提取→浓缩→乙醇沉淀→有机溶剂脱水→真空干燥→枸杞多糖粗品→DEAE纤维素（OH-）柱分级→浓缩→葡聚糖凝胶G-25脱盐→浓缩→冷冻干燥→枸杞多糖。

熊俐等[19]利用正交试验究验了温度、料液比和提取次数对枸杞多糖热水浸提的影响，以探索最佳提取工艺。结果表明：提取温度对枸杞多糖纯度和得率的影响显著( P< 0.05 )， 两者都随温度的上升而呈上升趋势；抽提次数对枸杞多糖得率的影响显著( P < 0.05 ) ，得率随抽提次数的增加而呈先升后降的趋势；最佳的提取工艺为：料液比1 ∶25，温度95℃，提取2 次，枸杞多糖得率为1.62%。

郝继伟[20] 采用超声波辅助技术提取枸杞多糖,并通过均匀设计法研究了液料比、提取时间、提取温度和超声功率对枸杞多糖提取的影响。枸杞多糖超声提取的最佳工艺为: 液料比21mL/g， 提取时间27min，提取温度63℃，超声功率200W，在该条件下枸杞多糖得率为5. 16%，且表现稳定。均匀设计法在优化枸杞多糖提取条件中应用效果良好。

苟春林[21]等利用枸杞干果通过氯仿-甲醇（2:1）脱脂、水提醇沉乙醇、丙酮洗涤干燥、双氧水脱色、savage 法除蛋白 DEAE-32 纤维素分离、Sephacryl S- 300 葡聚糖凝胶纯化，提取符合枸杞多糖高效液相色谱指纹图谱仪器条件要求的多糖制品，并且建立枸杞多糖高效液相色谱化学指纹图谱分析的样品预处理技术系统。

2.2 枸杞多糖的精制

枸杞多糖的纯化精制可先除蛋白，后脱盐精制，也可使用柱层析法。去除蛋白一般采用那些使蛋白质沉淀而多糖不沉淀的试剂，如酚、三氯乙酸、鞣酸等，近年也有采用Sevag 法，即氯仿∶戊醇（或丁醇）以4 ∶1 比例混合后，加到样品中振摇，样品中的蛋白质变性成不溶状态，存留在氯仿和水交接面后离心除去。

2.3枸杞多糖的含量测定

测定枸杞多糖含量的方法有：重量法、硫酸- 苯酚分光光度法、生化分析法、比旋度及示差折射法等。重量测定法原理是先用80%的乙醇提取以除去单糖、低聚糖、生物碱等干扰性成分，然后用水提取其中所含的多糖类成分。硫酸- 苯酚分光光度法原理是多糖类成分在硫酸作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后和苯酚缩合成有色化合物，在适当波长处测定其含量。实验研究一般采用分光光度法。韩晋、陈旭红等人分别把硫酸- 苯酚分光光度法与生化分析法、重量法进行了比较，结果得出：分光光度法与生化分析法统计学处理无明显差异，用分光光度法测定枸杞多糖含量，其显色稳定，灵敏度高，重现性好，但较繁琐；生化分析法具有灵敏快速，样品用量少、精密等优点，适合医院药房快检[22]；重量法和硫酸- 苯酚分光光度法的测定值相差很少，同时重量法方法简便，所用试剂少，灵敏度高，且可省去脱脂步骤。因此，在实际生产操作中宜采用重量法[23]。

三，研究内容

枸杞中的化学成分比较复杂，主要包括蛋白质、氨基酸、微量元素、糖类、脂肪、脂肪酸、菇类、甾醇类、维生素、色素类、生物碱类。

枸杞多糖（LBP)是枸杞有效成分之一，是植物多糖中少有的含蛋白质多糖。从枸杞中分离得到的枸杞多糖，有六种已碳糖（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖）组成的多糖侧链和18种氨基酸组成的蛋白质主链，以Glycan-O-Der方式连接，这种糖蛋白具有生物活性，是一种高强度的免疫增强剂。枸杞多糖一般作为保健食品的原料，可提高人体免疫力，增强造血功能，保肝降压，增强细胞活性，在医药、保健食品等领域应用广泛。

我所做的主要是从以下方面进行：

1.枸杞多糖提取原理

1.2   提取流程的选择 

1.3　 脱蛋白

1.4　 乙醇沉淀多糖的适宜浓度 

2.实验方法

2.1  枸杞粗多糖的提取

2.2  Sevage法脱蛋白

2.3  提取工艺的优化

3.   实验结果

3.1  精制枸杞多糖的得率

3.2  蛋白质含量

4.  结论

四，参考文献

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