负载吲哚箐绿的自组装靶向纳米给药系统的构建_开题报告

1研究背景 

全球肿瘤流行病统计数据显示，2012 年世界范围内的癌症新确诊人数为1410 万，癌症致死人数为 820 万[1]；到了 2013 年，癌症在世界范围内的致死人数为 800 万，使癌症从 1990 年的人类第三大死亡原因上升为仅次于心血管疾病的第二大死亡原因[2-4]。近年来，虽然人们针对某些癌症的治疗方案和预防上取得了很大的进步[5-7]，癌症带来的社会负担随着世界人口的增长、老龄化问题以及吸烟、肥胖和饮食模式等危险因素越来越沉重[8]。目前针对癌症的治疗手段主要有三种：手术治疗[9, 10]，放射治疗[11]以及化学治疗[12]。在这些治疗方法中，化学治疗由于制剂的高细胞毒性，其治疗效果高于其他治疗方法，已经成为治疗大多数癌症的首要策略[13]。但是，由于传统的化疗制剂往往具有自身的局限性，例如在体内的非特异性分布（对肿瘤组织和正常组织无选择性），较差的生物利用度，半衰期较短而被机体快速清除以及在生理环境下的溶解性较差等，导致化疗效果不理想且毒副作用较大[14-16]。为了解决这些问题，以纳米材料例如脂质体[17]，胶束[18]，聚合物纳米粒[19]，纳米凝胶[20]，纳米纤维[21]，无机纳米材料[22,  23]等为载体的新型给药系统获得了广泛的关注[24]。通过把化疗药物包载于纳米材料中可以减少药物在体内的清除，提高抗癌药物的生物利用度以及药物在肿瘤部位的蓄积[25-29]。然而，只有极少的纳米治疗剂被美国食品药品监督管理局批准用于癌症治疗，这是因为目前的技术与临床转化存在巨大的差距[30,  31]，纳米制剂中加入了大量的纳米载体，不可避免地会产生一些问题。例如这些纳米制剂的载药率较低（一般低于 10%），单分子前药的过早降解，药物发生泄漏[32-34]等等。而且，大多数给药系统的载体只是单纯的用来载药，并没有直接的治疗作用，这些载体在体内代谢有可能会产生短期或长期的毒性。除此之外，这些载体也可能会引起机体对载体或治疗药物的免疫反应[35-37]，因而极大地限制了其在临床上的应用。

2研究内容及思路

本研究通过3,3'-二硫代二丙酸将抗肿瘤药物阿霉素和抗自噬药物羟基氯喹化学连接起来得到还原敏感性药物DOX-SS-HCQ，并通过一系列的表征如紫外可见全波长扫描，核磁共振氢谱等方法考察药物的化学连接情况以及用透射电镜，粒度分析和动力学模拟等方法考察药物自组装成纳米粒后的形态特征。然后，将吲哚菁绿物理吸附到药物载体中，之后再用磷脂聚乙二醇叶酸（2KDa)包裹纳米粒形成负载吲哚菁绿的自组装多功能革E向纳米给药系统ICG/DOX-SS-HCQ/DSPE-PEG-FA。最后，考察了制剂在不同的谷胱甘肽浓度下释放阿霉素的情况以及制剂在808 nm激光照射下的温度变化情况。

3研究目标及技术路线

近年来关于纳米给药系统的研究越来越多，相比常规药物其靶向性好、功能多样等优点已经被广泛认可。但目前的纳米给药系统仍然有诸多缺点，比如载体生物相容性较差、毒副作用较大。小分子自组装纳米药物由于避免了高分子载体的引入，减轻了给药系统对机体毒副作用而受到越来越多的关注。有文献报道，在两个疏水性药物之间引入一个二硫键，可以平衡分子间的作用力，形成一种比较稳定的纳米结构，而且，二硫键本身具有还原敏感性，在还原性谷胱甘肽的作用下可以迅速断裂，从而释放药物。但是，目前的抗肿瘤药对肿瘤细胞的杀伤作用有限，其中一个重要的原因就是肿瘤细胞在化疗药物刺激下，会通过自噬保护自己，导致药物疗效不佳，肿瘤复发率较高。在肿瘤治疗中，羟基氯喹由于可以抑制自噬体与溶酶体的融合，打断肿瘤的自我保护途径，常被用来与化疗和放疗药物联合使用，从而提高肿瘤杀伤力。相比单一的化学疗法，化疗与热疗相结合的治疗效果更佳，吲哚菁绿是FDA批准的具有近红外特性的光学诊断试剂，不但具有良好的光学成像功能，而且在近红外激光照射下具有优良的光热转换效率，可以使肿瘤局部温度骤升，杀死癌细胞。

4创新点

本课题将临床上常用的抗肿瘤药物阿霉素与具有抗自噬作用的羟基氯喹通过具有还原敏感性的二硫键作为连接臂化学连接起来，合成了一种在水中能够自组装成纳米粒（粒径为130nm左右）的化合物，通过负载具有光学成像和光热转换功能的吲哚菁绿，再进行PEG化,成功地构建了一种化疗与热疗相结合、还原敏感性的自组装多功能靶向纳米给药系统ICG/DOX-SS-HCQ/DSPE-PEG-FA,然后在细胞水平和动物水平对该给药系统进行了全面的考察。本课题主要包括以下3个部分：

1、ICG/DOX-SS-HCQ/DSPE-PEG-FA靶向给药系统的构建。首先合成DOX-SS-HCQ,将3,3’-二硫代二丙酸两端的羧基酰氯化，再分别与阿霉素和羟基氯喹相连，制备出可在水中自组装的DOX-SS-HCQ,通过紫外波谱扫描，核磁共振氢谱，透射电镜等分析方法对其进行表征。然后将吲哚菁绿物理吸附到此纳米粒中，再用磷脂聚乙二醇叶酸（DSPE-PEG-FA)包裹纳米粒形成负载吲哚菁绿的自组装多功能靶向纳米给药系统ICG/DOX-SS-HCQ/DSPE-PEG-FA。然后进一步考察了该给药系统在体外的药物释放和光热转换效率。实验结果表明在还原性谷胱甘肽的作用下，给药系统中的二硫键能够迅速断裂，释放出游离药物阿霉素和羟基氯喹；在808nm激光照射下，该给药系统能够快速有效地将光能转化为热能。

2、通过荧光显微镜观察了纳米制剂在MCF-7细胞中的摄取情况。结果表明带有叶酸靶头的纳米制剂能够通过MCF-7细胞膜表面的叶酸受体介导的内吞途径快速进入细胞，并在细胞浆中谷胱甘肽的作用下，二硫键发生断裂，释放出游离药物阿霉素并进入细胞核发挥药效。采用SRB法考察了纳米制剂对MCF-7细胞的抑制率。结果表明，阿霉素原料药和纳米制剂都随着时间延长和浓度增大，对细胞的毒性也越来也大，在作用时间相同、阿霉素浓度一样时，与原料药阿霉素相比，ICG/DOX-SS-HCQ/DSPE-PEG-FA纳米制剂的细胞毒性明显增强，结合808nm激光照射后，纳米制剂的细胞毒性更加显著。然后用流式细胞仪考察了纳米制剂对MCF-7细胞的细胞周期和凋亡的影响。细胞周期结果显示，与原料药阿霉素相比，ICG/DOX-SS-HCQ/DSPE-PEG-FA纳米制剂可以更有效地将MCF-7细胞阻滞在S期，这种效果在结合808nm激光照射后会更加明显。细胞凋亡结果显示，ICG/DOX-SS-HCQ/DSPE-PEG-FA纳米制剂在808nm激光照射下的总凋亡率达到了75%,远远高于阿霉素原料药的22%。最后通过免疫荧光实验考察了羟基氯喹对细胞自噬的影响。结果表明，在阿霉素的刺激下，细胞会增强自噬以保持存活，而羟基氯喹可以有效地抑制自噬，增强阿霉素的治疗效果。这些结果说明，联合化疗与热疗的纳米制剂在体外能够快速被MCF-7摄取并对其产生较大的毒性。

3、应用光学活体成像系统考察了ICG/DOX-SS-HCQ/DSPE-PEG-FA纳米制剂经尾静脉注射后在荷瘤裸鼠体内的分布情况。结果表明，与游离的吲哚菁绿相比，ICG/DOX-SS-HCQ/DSPE-PEG-FA给药系统在体内的滞留时间更长，在肿瘤部位的蓄积也更多，显示出该给药系统具有长循环和良好的肿瘤靶向性。小鼠药效学结果表明，与阿霉素原料药相比，纳米制剂组可以有效的抑制肿瘤生长，特别是使用808nm激光照射后，肿瘤的体积有所减小，Tunel染色结果也显示了纳米制剂特别是激光照射组能够导致更多的细胞凋亡，说明ICG/DOX-SS-HCQ/DSPE-PEG-FA纳米给药系统能够有效地抑制肿瘤生长，产生良好的治疗效果。

以上研究结果表明，本课题构建的ICG/DOX-SS-HCQ/DSPE-PEG-FA纳米

给药系统是一种具有谷胱甘肽响应性、光学成像、靶向性、化疗与热疗为一体的新型药物传递体系，在肿瘤的治疗中具有良好的应用前景。

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