大丽轮枝菌的遗传转化_开题报告

黄萎菌研究进展

    自1915年首次出现棉花黄萎病的报道以来，国内外学者就展开了对棉花黄萎病菌的深入研究。首先，国外学者通过形态学及血清学的方法，将棉花黄萎病分为大丽轮枝菌和黑白轮枝菌两个种{11-12}。此后，对棉花黄萎病菌的研究主要集中在致病力和种内分化上。有人从抗病品种的病株上分离得到大丽轮枝菌，接种到其他棉花品种上，根据致病力的不同，将大丽轮枝菌分为三个生理型{13}；有研究人员通过比较美国和世界各主要产棉区的棉花黄萎病的致病力差异，将供测菌株分为落叶型和非落叶型{14}。

随着分子生物学的迅猛发展以及实验技术手段的飞跃进步，有人运用限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)技术，对棉花黄萎病菌的致病力分化进行研究，根据不同谱带，将棉花黄萎病分成两个致病种，即大丽轮枝菌和黑白轮枝菌{15}。1996年，吴献忠等{16}在国内首次利用改进的RFLP技术对不同致病力的棉花黄萎病菌进行了分类鉴定。

    进入21世纪以来，对棉花黄萎病的定性分析，已满足不了实际需求。科研工作者逐步将目光转移到定量研究上。2004年Schena等{17}提出实时荧光定量PCR可作为一项新技术研究病原真菌。由于黄萎病菌的发病具有潜伏期，Gayoso等{18}（2007）运用实时荧光定量PCR对茄科植物根部和土壤中的黄萎病菌进行了定量检测，可在植株显症前对病症进行准确的分析和预测。Bingnan Wang等{19}（2012）就黄萎病菌诱导烟草的抗性反应进行了研究。

大丽轮枝菌遗传转化的研究进展

    早期，为了促进棉花黄萎病菌致病性的遗传分析，研究人员开发了DNA介导的转化系统{28}。此方法在早期棉花黄萎病菌转化中应用较为广泛。而目前应用于大丽轮枝菌的遗传转化则大多采用根瘤农杆菌介导的遗传转化方法（ATMT）。

   根瘤农杆菌A.tumefaciens是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌

，能在自然条件下侵染多种植物的受伤部位，并诱导产生肿瘤，该天然载体在很多转基因的转化研究中得到了广泛的应用{29-31}。农杆菌介导的遗传转化（ATMT）方法突破了传统真菌遗传转化方法效率低、转化子不稳定的瓶颈，为真菌遗传转化研究开创了一条新的途径{32}。

为使ATMT法能更好的应用于大丽轮枝菌的遗传转化，研究人员做了很多努力，彭姗等{33}构建用于棉花黄萎病菌转化用的T-DNA载体，并将其转入农安菌中，为黄萎病菌的遗传转化奠定基础。韩绍辉等{34}就农杆菌介导的大丽轮枝菌的遗传转化进行了研究，证明利用ATMT方法介导大丽轮枝菌的遗传转化是可行的。陈强等{35}就ATMT法转化黄萎病菌的条件如抗生素的使用浓度、共培养时间进行优化，得到优化条件：农杆菌与黄萎病菌的共培养时间为48h，筛选的潮霉素浓度为50ug.ml﹣1。陈天子等{36}也就农杆菌介导转化大丽轮枝菌的体系进行了优化。Katherine等将大丽轮枝菌枯萎病菌中的胰蛋白酶基因VTP1，构建 缺失突变体通过ATMT法转化到大丽轮枝菌中，从而在分子水平上研究黄萎病病原菌的影响。

二、^范文提纲

一、棉花黄萎病研究概况

1.1黄萎菌概述

1.1.1棉花黄萎病简介

1.1.2黄萎菌研究进展

1.1.3大丽轮枝菌致病机理

1.1.4棉花黄萎病的防治

1.2大丽轮枝菌遗传转化的研究进展

1.3研究目的及意义

二、实验设计

2.1实验内容

2.2实验技术关键

2.3实验技术路线

三、实验过程

3.1材料与试剂

3.1.1材料

3.1.2酶与试剂

3.2农杆菌的转化

3.3利用ATMT法进行大丽轮枝菌T-9的遗传转化

3.4SDS-CTAB法提转化子基因组

3.5PCR检测

3.6转化子的观察

四、实验结果

4.1基因组鉴定及PCR检测结果

4.2观察结果

4.2.1载体pBHt1构建的转化子观察

4.2.2空载体pHMG构建的转化子观察

五、总结与讨论

三、参考文献

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